공중합체 PVI/PVP를 통한 와인에서 구리 제거: 구리 성분 및 결합제에 미치는 영향

연구배경
구리(Cu)는 모든 와인에서 흔히 발견되는 금속 이온으로, 농도는 일반적으로 0.5mg/L 미만입니다. 와인에 함유된 구리는 살균제 적용, 토양 흡수 등 포도재배에서 발생하거나 와인 생산 중(와인 메이커에 의한 오염 및 첨가물 포함) 발생할 수 있습니다. 실제로, 구리는 이러한 불리한 향기 화합물과 비휘발성 복합체를 형성함으로써 황화수소로 인한 악취를 감소시키는 것을 억제하기 위해 의도적으로 와인에 첨가되는 경우가 많습니다. 과도한 황화수소는 와인의 구리를 구리 유기산 복합체로 만들 수 있으며, 이러한 형태의 구리는 와인이 단기간에 황화수소 축적에 의해 영향을 받지 않도록 할 수 있습니다. 와인 생산에서 남은 황화구리 복합체의 경우 후속 여과(0.45μm 또는 0.20μm)를 통해 제거하지 못하는 경우가 많습니다. 마지막으로 와인에 구리가 너무 많으면 구리 안개가 발생할 수 있지만 이는 일반적으로 현대 와인 제조에서 일반적으로 발생하는 것보다 훨씬 더 높은 농도의 구리를 필요로 합니다.
연구의 목적은 와인과 표준 와인 샘플에 들어 있는 다양한 형태의 구리에 대한 두 가지 유형의 폴리비닐이미다졸/폴리비닐피롤리돈(PVI/PVP)의 제거 효과를 평가하는 것이었습니다. 예비 분석을 통해 이번 연구는 화이트 와인의 구리 제거 효율이 레드 와인의 구리 제거 효율보다 높다는 확실한 설명을 제공합니다. 그런 다음 이전에 검증된 전기화학, 비색 및 심층 여과 기술을 사용하여 구리 형태를 측정합니다. PVI/PVP 처리된 와인에 구리 결합제가 남아 있는지 여부에 대한 통찰력을 얻기 위해 이 연구에서는 잔류 황화수소 및 메틸메르캅탄 농도를 측정하고 처리된 와인의 구리 결합 능력을 평가했습니다. 마지막으로, 정화된 구리 부산물, 즉 폴리티안에 대한 PVI/PVP의 제거 활성을 평가하기 위해 표준 와인 샘플을 연구했습니다.
재료 및 방법

1 화학물질 및 와인 샘플
Cu(1000mg/L, ICP 등급), 황화나트륨(99.5%), 메스황산나트륨(90%), L-시스테인(98%) 및 환원된 L-글루타티온(98%)은 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 재활용 셀룰로오스 0.2μm 멤브레인 주사기 필터(Phenex)는 Phenomenex에서 제공됩니다. Milli-Q Plus 정수 시스템을 통해 초순수(18.2 MΩcm)가 생성됩니다.
본 연구에서 사용된 12%(v/v) 에탄올 수용액은 12%(v/v) 에탄올 수용액, 0.011M 주석산수소칼륨, 0.007M 타르타르산(pH 3.2)으로 구성되었다. 이번 연구에서는 2019년 다양한 포도 품종의 화이트 와인 4종(pH 3.1±0.2, 알코올 12.0±0.5%(v/v))과 레드 와인 4종(pH 3.5±0.1, 알코올 13.0±0.5%(v/v))을 사용했습니다. 및 2020. 연구된 와인에 다양한 형태의 구리를 제공하기 위해 화이트 와인 4(W4)와 레드 와인 4(R4) 모두 샘플 준비 전에 0.3mg/L의 구리(II)를 첨가했고, 샘플 준비 전에 구리는 첨가하지 않았습니다. 다른 와인들.

2 구리의 PVI/PVP 활동
다음 절차에서는 와인에 PVI/PVP를 추가하기 위한 표준 상업적 절차를 주로 기반으로 한 실험 작업을 통해 표준 와인, 화이트 와인 및 레드 와인에 PVI/PVP를 적용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 표준 와인(3.5L)은 200mg/L 카페인산, 170mg/L 화이트 와인 다당류 및 50mg/L 이산화황과 함께 12%(v/v) 에탄올 수용액(pH 3.2)을 사용하여 제조되었습니다. 표준 와인이 화이트 와인처럼 거동하도록 하기 위해 다당류를 첨가하고 기기 분석 전에 재생 셀룰로오스 멤브레인 필터에 흡착하여 가장 작은 황화물 결합 구리를 제거할 수 있습니다. 표준 와인은 용존 산소 농도가 0.3mg/L 미만이 될 때까지 질소로 가스를 제거합니다. 그런 다음 모든 후속 단계가 수행되는 혐기성 마스크(산소 농도 < 10%(v/v) 공기 포화도)로 옮겨집니다. 여기에는 황화수소(황화나트륨) 129μg/L(3.78μM)과 구리(II) 0.3mg/L(4.72μM)을 표준 와인에 첨가하여 황화수소 대 구리의 몰비가 0.8:1이 되도록 하는 것이 포함됩니다. (II). 30분 후 준비된 표준 와인 샘플 100mL를 채취하여 “MW0” 라벨을 붙여 분석합니다. 나머지 표준 와인은 9개의 250ml Schott 병으로 완전히 채워지며, 처리 후 밀봉되어 병 내부에 공간이 남지 않습니다.

3 폴리티안에 대한 PVI/PVP의 활성
표준 와인의 폴리티안 생산은 Bekker et al.의 설명에 따라 표준 와인 200ml에 황화수소 8.5mg/L를 첨가하여 수행됩니다. 표준액 100ml에 L-시스테인 69mg/L를 첨가하고, 나머지 100ml에는 L-글루타티온 181mg/L를 첨가한다. 두 샘플 모두 5.6 mg/L 철(II)과 3.2 mg/L 구리(II)를 첨가하고 공기를 배제하지 않고 실온에서 72시간 동안 보관했습니다. 그런 다음 샘플을 3회 준비하고 준비된 표준 와인 10mL를 22ml 호박색 병에 옮기고 질소를 채웠습니다. 그런 다음 미리 준비된 PVI/PVP 현탁액 0.1mL를 첨가하여 0.5g/L 농도의 PVI/PVP를 얻었고, 대조 시료에 12%(v/v) 에탄올 수용액 0.1mL를 첨가했습니다. 모든 샘플을 실온에서 5시간 동안 교반한 후 폴리티오안 및 총 구리 분석을 위해 0.2μm RC 필터를 통해 여과했습니다.

4 화학 분석
모든 구리 분석 방법은 이전에 검증된 방법을 사용했습니다(표 1 참조). 표준 와인과 레드 와인의 총 구리 농도는 유도 결합 플라즈마 방출 분광법으로 분석되었습니다. 표 1에는 표준 와인 샘플, 화이트 와인 및 레드 와인에서 구리 함량과 구리 형태를 정량화하는 데 사용되는 다양한 방법이 요약되어 있습니다.

샘플의 구배는 (시간, %A): 0분, 97%; 10.0분, 55%; 12.0분, 25%; 17.5분, 25%; 20.0분,97%; 28분의 97% 주입 부피는 5 μL였으며 바늘은 주입 사이에 5초 동안 10%(v/v) 아세토니트릴 용액으로 세척되었습니다. HRMS는 양이온 모드가 다음과 같이 설정된 확장된 동적 범위(2GHz) 모드에서 작동합니다. 스캔 속도 5 스펙트럼/SEC, 내부 질량 보정을 위한 기준 이온은 퓨린(m/z 121.050873) 및 HP-0921(m/z)입니다. 922.009798), 건조가스 온도 300 ℃, 건조가스 유량 8 L/min, 분무기 압력 35 psi, 피복 온도 350℃, 피복 가스 유량 11 L/min, 모세관 전압 5500 V, 노즐 전압 1000 V, 슈레더 전압 80 V, 분리기 1 전압 65V 및 옥토폴 RF 피크 전압 750V. 각 고해상도 m/z 값에 대한 질량 강도 신호는 서로 다른 글루타티온 및 시스테인 유래 폴리티안(표 2)에 해당하며 글루타티온과 동등한 것으로 정량화됩니다. (m/z 308.091) 및 시스테인(m/z 122.027).

연구결과
1 PVI/PVP 총 구리 제거: 화이트 와인 및 레드 와인
PVI/PVP 화이트 와인의 총 구리 제거 효율이 레드 와인의 총 구리 제거 효율보다 높은 이유를 알아보기 위해 pH 값과 총 구리 제거율 간의 관계를 연구했습니다. 레드 와인은 일반적으로 화이트 와인보다 pH가 더 높은 것으로 알려져 있으므로 와인의 pH는 특히 중요합니다. Hirlam et al. PVI/PVP 처리 와인의 pH 값을 발표하지 않았으므로 연구에서는 이 데이터 세트를 수집했으며 이러한 데이터를 재분석한 결과는 그림 1에 나와 있습니다.

그림 1에서 볼 수 있듯이 와인의 pH와 제거된 구리의 양(총 구리 대비 백분율) 사이에 좋은 관계(R2 = 0.726)가 확립되어 와인의 낮은 pH에서 구리 제거가 더 효율적으로 이루어졌습니다. 총 구리 제거율 대신 절대 농도 단위를 사용하는 경우에도 비슷한 결과를 얻을 수 있습니다(그림 1).
낮은 pH에서는 PVI/PVP가 Cu의 경쟁적 결합 및/또는 흡착에 더 유리한 반면, 높은 pH에서는 와인 기질이 이러한 구리 제거 메커니즘을 억제할 수 있는 것으로 추측됩니다. 그러나 그림 1의 데이터는 완벽한 선형 적합에서 벗어났습니다. 이는 와인의 pH 이외의 요인도 이러한 와인 샘플에서 PVI/PVP의 구리 제거 효율에 영향을 미치고 있음을 나타냅니다.

2 다양한 구리 성분 측정
표 1은 표준 와인, 화이트 와인, 레드 와인의 구리 함량을 측정하는 다양한 기술을 요약하고 이전 연구를 기반으로 한 각 구성 요소의 주요 귀속 형식도 포함합니다. 본 연구에서는 황화수소와 구리(II)가 포함된 표준 와인을 전기화학적 방법으로 분석한 결과, 표준 와인에 포함된 황화물 결합 구리와 황화물이 없는 구리를 구별할 수 있었습니다. 화이트 와인의 경우 비색법으로 세 가지 구리 성분을 구별했는데, 이는 주로 구리 유기산, 구리 메르캅탄 및 구리 황화물 착물에 속합니다.

3 PVI/PVP 처리가 와인의 총 구리 농도 및 구리 조성에 미치는 영향
그림 2는 PVI/PVP 처리 전후의 와인 ​​내 총 구리 및 기타 구리 성분의 농도를 보여줍니다. 총 구리 농도 간의 차이에 대한 통계적 분석은 그림 2에 포함되어 있습니다. 표준 와인, 백포도주 및 적포도주에서 총 구리 농도는 PVI/PVP 처리 후 크게 감소했습니다(그림 2). 다양한 구리 성분에 대한 PVI/PVP 제거 활동에 따라 PVI/PVP는 화이트 와인의 각 구리 성분을 효과적으로 감소시킬 수 있습니다(그림 2). 레드 와인에 비해 화이트 와인에서 구리를 더 효율적으로 제거하는 것은 와인의 pH와 관련이 있지만(그림 1), 이는 구리 성분 I이 레드 와인보다 화이트 와인에서 더 쉽게 제거되기 때문인 것으로 보입니다. 레드 와인(그림 2).

4. 구리 바인더에 대한 PVI/PVP의 영향
처음에 이 연구에서는 0.3mg/L의 구리(II)를 첨가했을 때 PVI/PVP 처리된 화이트 와인의 구리 성분 III으로의 전환 능력을 평가했습니다. PVI/PVP가 황화구리 착물에서 구리를 분리하여 황화물을 착화되지 않은 황화수소로 남겨두면 첨가된 구리(II)는 황화물에 결합된 구리(즉, Cu 성분 III)로 쉽게 전환됩니다. 또한, 황화구리 착물이 전체적으로 PVI/PVP에서 제거되는 경우, 후속 구리(II)의 첨가는 구리 성분 I 및/또는 구리 유기산 및/또는 구리 메르캅탄 착물에 주로 존재한다. II. 그림 3에서 볼 수 있듯이, PVI/PVP 처리된 화이트 와인(W1-W4)에 첨가된 구리(II)는 미량의 구리 성분 III만 형성할 수 있으며, 이는 주로 구리 성분 I과 구리 성분 II로 나타납니다. 실제로 PVI/PVP로 처리된 모든 화이트 와인에서 구리 성분 III의 양은 ​​미미한 것으로 간주됩니다.

PVI/PVP 처리된 와인과 PVI/PVP 처리되지 않은 와인에 대한 GC-SCD 분석에서는 PVI/PVP 처리 후 와인에서 염을 방출하는 황화수소 농도가 감소한 것으로 나타났습니다. 이는 구리와 이에 결합하는 황화물이 제거되었다는 추가 증거입니다. 와인에서(그림4A). 균형 잡힌 물질의 비율은 전체 메르캅탄 농도와 와인의 구리 성분 I 및 II의 농도에 따라 달라집니다. 이러한 결과는 PVI/PVP 처리 전후에 와인의 메탄티올 농도가 감소하지 않았다는 것과도 일치합니다(그림 4B).

5 PVI/PVP 처리가 와인의 폴리티오안 농도에 미치는 영향
일단 와인에 있는 구리, 황화수소, 메르캅탄 화합물이 반응하여 폴리티올을 형성하면, 이들이 구리와 얼마나 강하게 결합하거나 상호 작용하는지, 그리고 PVI/PVP 처리를 통해 와인에서 제거할 수 있는지 여부는 알 수 없습니다. 표 2에서 볼 수 있듯이, 이 와인 기질에서 구리가 효과적으로 제거되었지만 폴리티안의 농도는 표준 와인의 PVI/PVP 처리에 영향을 받지 않습니다. 이 결과는 PVI/PVP가 폴리티오안 존재 하에서 구리를 효과적으로 제거할 수 있음에도 불구하고 PVI/PVP와 구리 사이에는 강한 상호작용이 없음을 보여줍니다. 이는 PVI/PVP가 폴리티오안 농도에 미치는 영향이 무시할 수 있음을 의미합니다.
결론
와인의 pH는 PVI/PVP에 의한 구리 제거에 영향을 미치므로, pH 값이 낮을수록 구리 제거가 더 효율적입니다. PVI/PVP 처리는 화이트 와인의 모든 구리 함량을 줄이는 데 효과적이지만, 레드 와인의 경우 PVI/PVP는 유기산에 결합된 구리보다 황화물에 결합된 구리를 제거하는 데 더 효율적입니다.
레드 와인의 이러한 결과는 유기산에 결합된 구리 성분의 제거를 방해하는 레드 와인의 더 높은 pH 때문일 가능성이 높습니다. 모든 와인의 PVI/PVP 처리 후 황화물은 첨가된 구리(II)에 대한 결합 효과가 최소화됩니다. 이는 황화물에 결합된 구리 복합체의 구리와 황화물이 PVI/PVP에 의해 제거된다는 것을 의미합니다. 화이트 와인의 경우, 메르캅탄에 결합된 구리의 일부가 공중합체 PVI/PVP에 의해 제거되더라도 PVI/PVP 처리 후 메르캅탄 화합물의 손실은 적습니다.
공중합체가 메르캅탄 관련 구리를 효과적으로 제거했지만 PVI/PVP는 표준 와인 샘플의 폴리티오안 농도에 영향을 미치지 않았습니다. 와인에 포함된 모든 형태의 구리 중에서 PVI/PVP는 와인의 향 감소와 관련된 구리에 대한 친화력이 가장 높으며 구리와 구리의 유해한 결합제를 함께 제거할 수 있습니다.